In 1559 verdwenen de oude middeleeuwse bisdommen in de Nederlanden, waaronder de bisdommen Luik en Utrecht. In plaats daarvan werden nieuwe, kleinere bisdommen gevormd. Ze ressorteerden alle onder het nieuwe aartsbisdom Mechelen. Een van die bisdommen was het bisdom 's-Hertogenbosch. De parochies die het omvatte hadden voor het grootste deel behoord tot het oude bisdom Luik. De stad ’s-Hertogenbosch werd zetel van het diocees. De Meierij lag in het hart ervan. De noordelijke grens van het bisdom werd gevormd door de Hollandse gebieden rondom Zevenbergen, Geertruidenberg, Woudrichem en Heusden, en de Gelderse Bommelerwaard (voorheen bisdom Utrecht) met Zaltbommel als centrum. Aan de oostzijde werden de parochies van het graafschap Megen en het Land van Ravenstein, alsmede Gemert, eraan toegevoegd. Ten zuiden van de Meierij lagen de parochies van Geel en omstreken, zodat de Abdij van Tongerlo nog binnen de grens van het bisdom kwam te liggen. In 1731 werd dit laatste gebied van het bisdom afgesplitst.
De Sint-Jan werd van collegiale kapittelkerk verheven tot bisschoppelijke kapittelkerk. De bisschop kreeg directe zeggenschap over het omgevormde kapittel. Dit leidde tot spanningen, omdat hiermee de autonomie van het kapittel werd aangetast. Om in een inkomen te voorzien kreeg de Bossche bisschop de Abdij van Tongerlo toegewezen. Hij werd daarvan qualitate qua abt, zodat hij over het abtsinkomen kon beschikken. De abdij was op zijn zachtst gezegd niet gecharmeerd van deze zogeheten commanditaire abt, omdat ze geen zeggenschap had in zijn benoeming en de financiële lasten van de bisschop moest dragen. Naast verzet van de kapittel en de grote abdijen, kreeg de eerste bisschop, Franciscus Sonnius, geïnstalleerd in november 1562, ook tegenwerking te verduren van de adel en functionarissen van het oude bisdom Luik, die hun posities bedreigd zagen.

De bisschop had onder meer tot taak toezicht te houden op de parochies en op bepaalde religieuze gemeenschappen, zoals kloosters en kapittels. Daarvoor beschikte hij over een staf, bestaande uit een aartsdiaken als assistent voor het dagelijks bestuur, een penitencier, bij wie personen met gewetenswroeging namens de bisschop vergeving van hun zonden konden krijgen, en een officiaal, de kerkelijke rechter van het bisdom. Daarnaast speelde zijn secretaris een belangrijke rol bij de administratieve afhandeling van de aan hem voorgelegde zaken. Voor het bestuur van de stadsparochie kon hij steunen op een aartspriester. Dit gebied werd in 1569 opgedeeld in vier parochies binnen de stad en een in het aangrenzende Den Dungen. Het onderhavige archief bevat de administratieve stukken per parochie en religieuze gemeenschap die uit de taken van de bisschop voortvloeiden.
Als vervolg op dit eerste decennium van opbouw werd Sonnius, die in 1570 bisschop van Antwerpen werd, opgevolgd door Laurentius Metsius. Na de beroeringen van de Beeldenstorm van 1566 boden de troepen van de hertog van Alva bescherming aan de kerk, zodat de nieuwe bisschop ongehinderd zijn zetel kon innemen. De eerste diocesane synode in 1571 leidde tot een herindeling van het bisdom. De 194 parochies werden ingedeeld in tien dekenaten: ’s-Hertogenbosch, Orthen, Oss, Geertruidenberg, Hilvarenbeek, Eindhoven, Helmond, Heusden, Zaltbommel en Geel. In de jaren zeventig verloor het bisdom de parochies in de Hollandse gebieden en de Bommelerwaard voor een groot deel. Ook in 's-Hertogenbosch kregen Calvinistische elementen de overhand en in 1577 nam de bisschop de wijk naar het zuiden. De komende jaren namen de aartsdiaken (Coeverincx), de officiaal (Tijpoets) en de zegelaar (Van Grinsven) de zaken waar.

Pas in 1584 werd een nieuwe bisschop benoemd: Clemens Crabeels. Hij kon het bestuur overnemen dat de voorafgaande jaren feitelijk was uitgeoefend door de kapitteldeken Lucas Dielen als plaatsvervanger (vicaris) van de bisschop. Het bisdom kwam in rustiger vaarwater. In 1590 kwam een einde aan het titulaire abbatiaat van de bisschop over Tongerlo.
Het plotselinge overlijden van Crabeels in 1592 leidde tot de uitoefening van de bisschoppelijke taken door kapittelvicaris Coeverincx totdat eind 1593 Ghisbertus Masius als vierde bisschop aantrad. Zijn langdurige aanblijven (tot 1614) en de tijdelijke wapenstilstand (1609-1621) leidden tot stabiliteit in het bisdom waardoor de Contrareformatie haar werk kon doen. Masius ondernam vele visitatiereizen naar zijn parochies en hield in 1612 de tweede diocesane synode. Met betrekking tot de parochies in het graafschap Megen en het Land van Ravenstein bestond er een langdurig geschil met het bisdom Luik over de geestelijke jurisdictie. In 1613 eindigde het conflict met Megen: vanaf dat jaar werd erkend dat de geestelijke jurisdictie over het graafschap toebehoorde aan de bisschop van ’s-Hertogenbosch. In het Land van Ravenstein werd het gezag van de Bossche bisschop aanvankelijk evenmin erkend. Na het Staatse intermezzo tussen 1618 en 1627 kreeg de katholieke kerk er haar oude rechten terug en ressorteerde het ook in de praktijk de volgende jaren onder het bisdom van ’s-Hertogenbosch. Het Land van Cuijk, Boxmeer en Oeffelt vielen al vanaf 1559 onder het nieuw opgerichte bisdom Roermond. Zij vormden het dekenaat Grave met vanaf 1602 als zetel Cuijk. Na de val van Grave in 1602 kwamen stad en land onder Staats bestuur, hetgeen leidde tot een verbod tot openlijke uitoefening van het katholieke geloof. Het zelfstandige Boxmeer en het Kleefse Oeffelt konden daarentegen katholiek blijven.

Bisschop Masius stierf in 1614. Zijn opvolger was Nicolaus Zoesius. In het daaropvolgende jaar werd hij benoemd en gewijd. Ook van hem zijn vele visitatiereizen bekend naar parochies, kloosters en kapittels. De hervatting van de oorlog in 1621 maakte het voor hem steeds moeilijker zijn taak uit te voeren en toezicht te houden op de parochianen in zijn diocees. In 1625 overleed hij. Hij werd in 1626 opgevolgd door de dominicaan Michael Ophovius. De druk van de oorlog werd groter en groter zodat hij zijn taak slechts moeizaam kon uitvoeren. De val van zijn bisschopsstad in 1629 betekende een breuk in zijn ambt. Na een reis door de Zuidelijke Nederlanden vestigde hij zich in het kasteel van Geldrop vanwaaruit hij zo goed en zo slecht als het ging zijn bisdom bestuurde. Vermoedelijk ten gevolge van het retorsieplakkaat van 2 december 1636, de ordonnantie van de Staten-Generaal die bepaalde dat de katholieke geestelijkheid de Meierij moest verlaten, heeft hij de wijk genomen naar Lier waar hij het jaar daarop stierf.
Door de dood van Ophovius kwam de bestuursmacht van het bisdom in handen van het kathedraal kapittel in de persoon van de kapittelvicaris Hendrik van den Leemputte. Deze situatie duurde tot 1647 toen Joseph Bergaigne tot bisschop was benoemd. Hij kon echter alleen nog maar toegang krijgen tot het dekenaat Geel, dat in Spaanse handen was gebleven. In de rest van zijn bisdom was Van den Leemputte namens hem bestuurder. Dit gold ook nog na de dood van de bisschop in 1656.
Uit angst voor de groeiende Staatse invloed in de Meierij opteerde de heer van Ravenstein voor nieuwe aansluiting bij het bisdom Luik. De paus stond dit in 1658 officieel toe. Een veertigtal jaar later, in 1697, volgde de nieuwe heer van Megen dit voorbeeld door de parochies in zijn gebied onder het dekenaat Ravenstein te plaatsen. Daardoor viel het graafschap opnieuw onder het bisdom Luik (in zijn nieuwe vorm).

Bergaigne was de laatste bisschop, oude stijl, van het bisdom. Na het overlijden van Van den Leemputte koos het resterende deel van het Bossche kapittel nog twee kapittelvicarissen: Henricus Vos (1656-1657) en Nicolaus van Broeckhoven (1657-1658). Daarna kwam het bestuur in handen van apostolisch vicarissen, aangestuurd door de nuntius in Brussel: Jacobus de la Torre (1657-1661), Eugenius d’Allamont (tevens bisschop van Roermond) (1662-1666), Judocus Houbraken (1666-1681), Wilhelmus Basserij (1681-1691), Martinus Steynaert (1691-1701), Petrus Govarts (tevens vicaris-generaal van het aartsbisdom Mechelen) (1701-1726), Gisbertus van der Asdonck (1731-1742), Martinus van Litsenborgh (1745-1756), Andreas Aerts (1763-1790) en Anthonius van Alphen (1790-1831). Intussen waren de Staten-Generaal zich met deze benoemingen gaan bemoeien. Vanaf Van der Asdonk waren zij hierbij betrokken. Om die reden werd in 1731 het in de Oostenrijkse Nederlanden gelegen dekenaat Geel van het bisdom afgescheiden. Vanaf Van der Asdonck resideerden de apostolisch vicarissen in Staats Brabant waar ze pastoors waren van respectievelijk Oirschot, Hilvarenbeek en twee keer Schijndel. Van Alphen was de persoon die ten gevolge van de veranderde politieke verhoudingen rond 1800 weer kon beginnen aan de opbouw van het bisdom.