Een van de drie takken van de religieuze beweging, die in de veertiende eeuw door Geert Grote vanuit de IJsselstreek werd gepropageerd, werd gevormd door de kloosters van de zusters des Gemenen Levens. Deze beweging, ook wel aangeduid als de Moderne Devotie, kenmerkte zich door een zeer praktisch gerichte vroomheid en boetvaardigheid. Anno 1388 blijken er ook in Rhenen al zusters van het Gemene Leven gevestigd te zijn. *  In dat jaar namelijk schonken de richter en de magistraat van de stad aan deze zusters het huis en de hofstede waarin zij woonden, vermoedelijk gelegen aan de Torenstraat (Kerkstraat). Ook stelden zij voor de devote vrouwen een ordonnantie op met hun kloosterprivileges en -statuten. * 

In deze ordonnantie werd ook een aantal bepalingen opgenomen aangaande de rechten en plichten van het zusterhuis ten opzichte van de stad. De zusters genoten vrijstelling van geldelijke bijdragen voor de waak, het graven en onderhouden van de stadsgracht en het betalen van schattingen. Zij vielen onder het stadsgerecht. Zij mochten geen nieuwe kloosterorde of bijzondere levensstaat aannemen, tenzij met toestemming van 'de heilige kerk zelf' (de kerkelijke autoriteiten). Zij moesten onderdanig zijn aan de pastoor en de 'kerspelluiden', en niet de wereld behagen, 'opdat sy den leven Ons Heren Jhesu Christi ende Sinre heiligen tegeliken ende te naere moghen volgen'-de kerngedachte van de Moderne Devotie. Verder moesten zij zelf in hun huis en hofstede de kost verdienen en mochten zij niet bedelen. Alleen in uiterste gevallen, als het voortbestaan van de gemeenschap in het geding dreigde te komen, zou dit worden gedoogd. De wijste en verstandigste zuster zou als 'maerte' de leiding krijgen en het huishoudelijk werk (waaronder het spinnen) onder de zusters verdelen. Uittredende zusters mochten ingebrachte goederen niet terugnemen. Intredende zusters mochten geen lid van een kloosterorde zijn. Er was op dat moment nog geen sprake van aansluiting bij een orde of congregatie. * 

De stad noemde de zustergemeenschap een 'geestelick geselschap'. Zij stelde zelf de regels voor het zedelijk leven der zusters en gaf de 'maerte' de bevoegdheid om bij terugkerend wangedrag individuele nonnen uit de gemeenschap te verwijderen. Ingeval van algehele wantoestand kon de stad zelf tot opheffing van het zusterhuis besluiten. Een echt klooster werd het pas toen de zusters zich aansloten bij de orde van penitentie (boetvaardigheid) en bisschop Frederik van Blankenheim in 1410 de nonnen toestemming gaf een eigen kapel te bezitten. *  Daarmee was het niet langer een stedelijke maar een bisschoppelijke instelling. De stichting van de vicarie in de kapel en de instelling van het daaraan gekoppelde ambt van priester-bewaarder of biechtvader (ook wel rector of pater genoemd) vonden een jaar later plaats. *  In 1418 werd de vicarie uitgebreid met een kapelanie ten behoeve van een tweede priester. *  In 1435 wordt deze kapel voor het eerst St. Agnietenkapel genoemd. De naam St. Agnietenklooster duikt in 1440 voor het eerst in de bronnen op. * 

In 1420 werden de rechten en privileges van het convent definitief vastgelegd door de landcommandeur van de Duitse orde te Utrecht. *  Dit gebeurde op verzoek van de pastoor van de Rhenense St. Cunerakerk, waarvan de Duitse orde het patronaats- en collatierecht bezat en waarvan het pastoorsambt consequent aan een broeder van het Duitse Huis werd toegewezen. Tot die rechten behoorden de wijding van de sacramentskapel en het kloosterkerkhof. Ook de keuze en de taakuitoefening van de biechtvader van het klooster werden hierin geregeld en nauwkeurig afgebakend ten opzichte van de rechten van de pastoor van Rhenen. Voorts werden bepalingen opgenomen over de inkleding, de professie en de eventuele seclusie van de nonnen van dit slotklooster. Opvallend is dat de zusters van het St. Agnietenklooster bij de bevestiging van deze privileges in 1420 nog niet over een eigen conventszegel beschikten.

De nonnen waren overwegend afkomstig uit de Rhenense burgerij of uit de welgestelde, soms adellijke families die goederen bezaten in de omgeving van de stad of in de Neder-Betuwe. Zij droegen een wit kleed met zwarte kap en een zwart bovenkleed. *  Naast godsdienstoefeningen verrichtten zij ook handenarbeid, zoals spinnen, weven of werkzaamheden op hun boerderij. De algehele leiding over het klooster berustte bij de ministerse (ook wel ministra of mater genoemd, of later priorin). Zij werd door de nonnen en de biechtvader gekozen. Aan haar waren de zusters absolute gehoorzaamheid verschuldigd. De biechtvader had de geestelijke leiding en trad op als de officiële gemachtigde van het convent buiten het klooster.

In kerkelijke documenten heette het klooster heette: 'Mater, rector, procuratrix, et conventus', of: 'Confessor, minister, et sorores ordinis Sancti Francisci de penitentia nuncupate domus sive conventus Sancte Agnetis in R(i)enen'. Vanaf 1410 viel het onder het kapittel van Utrecht van de zusters franciscanessen van de derde orde. Begin zestiende eeuw waren bij dit kapittel tal van kloosters aangesloten met in totaal meer dan vierhonderd nonnen. * 

Vóór 1470 lag het St. Agnietenklooster in de Torenstraat aan de westzijde van het kerkhof, vlakbij de St. Cunerakerk. *  Nadat het klooster in 1465 een aantal percelen had aangekocht van de stad, de commanderij van de Duitse orde en de familie Van Hemerten, kwam het in 1470 tot uitbreiding, nieuwbouw en gedeeltelijke verplaatsing van het klooster. Dit gebeurde met toestemming van hun kloosterheer, bisschop David van Bourgondië. Het vernieuwde kloostercomplex lag aan de Herestraat en de westelijke hoek van de Torenstraat, met aan de overzijde van de Torenstraat de kloosterboerderij. * 

Vermoedelijk in verband met de plannen voor uitbreiding en nieuwbouw ontving het klooster 1465 verdere vrijstelling van de stedelijke belastingen en de verplichtingen ten aanzien van het onderhoud van de stadsgrachten en de waak bij de stadspoorten. Voorts beloofde de stad de nonnen alle vrijheid ten aanzien van hun bezit van de onderaardse gang van het klooster naar de St. Cunerakerk-een voor Nederland unieke constructie-en van hun graanzolders. *  In 1483 heeft de magistraat van Rhenen niet alleen de stedelijke kloosterprivileges bevestigd, maar deze ook nog uitgebreid met het recht van een onderaardse doorgang vanaf het klooster onder de Torenstraat door naar hun boerderij en schuren aan de overzijde van de straat. * 

Daarna leek het erop dat de opbouwfase van het klooster en het goederenbezit was voltooid en dat er een periode van consolidatie zou aanbreken. De rust werd echter wreed verstoord door de Kleefse verovering en de brandschatting van de stad Rhenen in 1499. *  . Ook het St. Agnietenklooster moet hier zwaar onder geleden hebben. In 1512 moest de kloosterkerk met de beide altaren opnieuw gewijd worden. *  De verovering van Rhenen door de Geldersen in 1527 *  en de verwoestende gevolgen van de Gelderse oorlogen in de jaren daarna maakten het tenslotte noodzakelijk dat omstreeks 1540 de goederenadministratie van het klooster volledig werd gereorganiseerd. Daartoe werd een nieuw cartularium aangelegd. *  Nadien werd de regelmaat van het katholieke religieuze leven van de zusters niet meer gestoord, totdat in 1580 ook in Rhenen de hervorming definitief en dwingend opgelegd werd.